Bojanje po Gramu brza je tehnika i koristi se za provjeru prisutnosti bakterija u uzorku tkiva i za klasifikaciju bakterija kao gram-pozitivnih ili gram-negativnih, na temelju kemijskih i fizičkih svojstava njihovih staničnih stijenki. Mrlja po Gramu se gotovo uvijek koristi kao prvi korak u dijagnosticiranju bakterijske infekcije.
Ova tehnika bojenja dobila je ime po danskom znanstveniku Hansu Christianu Gramu (1853 - 1938), koji je tehniku razvio 1882. i objavio 1884. kao tehniku za razlikovanje dvije vrste bakterija sa sličnim kliničkim simptomima: Streptococcus pneumoniae (također poznat kao Streptococcus pneumoniae). Pneumococci) i bakterija Klebsiella pneumoniae.
Korak
Metoda 1 od 3: Priprema stakalca za mikroskop
Korak 1. Pripremite se za rad u laboratoriju
Nosite rukavice i dugu kravatu za kosu kako biste spriječili bakterijsku kontaminaciju uzorka koji testirate. Očistite radni prostor ispod dima ili u drugom dobro prozračenom prostoru. Prije početka provjerite Bunsenov plamenik i provjerite radi li mikroskop ispravno.
Korak 2. Sterilizirajte stakleno staklo mikroskopa
Ako je stakleno staklo prljavo, operite ga sapunom kako biste uklonili ulje i prljavštinu. Očistite stakalca etanolom, sredstvom za čišćenje stakla ili drugom metodom koju koristi vaš laboratorij.
Korak 3. Stavite uzorak na staklo
Tehniku bojenja po Gramu možete upotrijebiti za identifikaciju bakterija u medicinskom uzorku ili kulturu bakterija koja raste u petrijevoj zdjelici. Za najbolje rezultate, nanesite mrlju po Gramu na tanke poteze uzorka. Preporučljivo je koristiti uzorke stare manje od 24 sata jer su starije bakterije mogle oštetiti stanične stijenke i možda neće reagirati na bojenje po Gramu.
- Ako koristite uzorak tkiva, dodajte 1-2 kapi na stakleno staklo. Ravnomjerno rasporedite po stakalcu tako da tvori tanak sloj prskanja uzorka klizanjem po rubu drugog sterilnog stakalca. Pustite da se osuši prije nego učinite sljedeći korak.
- Ako uzimate bakterije iz Petrijeve zdjelice, sterilizirajte petlju cijepljenja u Bunsenovom plameniku dok ne zasvijetli, a zatim je ostavite da se ohladi. Pomoću petlje kapnite sterilnu vodu na stakalce, zatim sterilizirajte i ponovno ohladite prije nego što je upotrijebite za prikupljanje malog uzorka bakterija. Nakon toga lagano promiješajte.
- Bakterije pripremljene u juhi moraju se ponovno promiješati pomoću vrtložnjaka, zatim uzeti s inokulacijskom petljom kao gore, bez dodavanja vode.
- Ako imate uzorak brisa (obično se radi s malom ručkom s vrhom pamuka), dodirnite i lagano zakrenite bris po pločici.
Korak 4. Malo visoka temperatura može dobro razmazati
Toplina će zadržati bakterije na vrhu stakalca, tako da se one ne otapaju lako tijekom procesa bojenja. Brzo dodirnite klizač dva do tri puta preko Bunsenovog plamenika ili zagrijte klizač preko električnog grijača. Nemojte se pregrijavati, uzorak se može oštetiti. Ako koristite Bunsenov plamenik, to bi trebao biti mali, ali plavi plamen, umjesto velikog narančastog plamena.
Alternativno, razmaz se može napraviti i s metanolom, dodavanjem 1-2 kapi metanola u suhi bris, sušenjem preostalog metanola na stakalcu, ostavljanjem na otvorenom. Ova tehnika minimizira oštećenje stanica i omogućuje čistu pozadinu slike slajda
Korak 5. Postavite klizač preko ladice za bojanje
Posude za bojenje izrađene su od metala, stakla ili plitkih plastičnih ploča s mekanom mrežicom na vrhu. Stavite dijapozitive na ove mreže, tako da se tekućina koju koristite može ispustiti u ladicu.
Ako nemate ladicu za bojanje, možete staviti slajd na plastičnu ladicu za ispis kockica leda
Metoda 2 od 3: Postupak bojenja po Gramu
Korak 1. Izlijte kristalno ljubičastu tekućinu preko razmaza
Pipetom poprskajte uzorak bakterije s nekoliko kapi kristalno ljubičaste boje, poznate i kao encijan ljubičica. Ostavite 30-60 sekundi. Kristalna ljubičica (KV) odvaja se u vodenoj otopini na KV+ i kloridne (Cl-) ione. Ti ioni prodiru u stanične stijenke i stanične membrane i gram-pozitivnih i gram-negativnih bakterija. KV+ ion stupa u interakciju s negativno nabijenim komponentama bakterijskih stanica, dajući stanicama ljubičastu boju.
Mnogi laboratoriji koriste "Hucker" kristal ljubičicu koja sadrži amonijev oksalat za sprječavanje taloženja
Korak 2. Lagano isperite kristalno ljubičastu boju
Nagnite klizač i upotrijebite bocu za pranje kako biste raspršili mali mlaz destilirane vode ili vode iz slavine preko stakalca. Voda bi se trebala slijevati po površini razmaza i ne smije se prskati izravno po razmazu. Ne ispirati pretjerano. Može ukloniti mrlje u gram pozitivnih bakterija.
Korak 3. Isperite razmaz jodom, a zatim isperite
Kapaljkom isperite razmaz jodom. Ostavite da djeluje najmanje 60 sekundi, a zatim pažljivo isperite na isti način kao gore. Jod, u obliku negativno nabijenog iona, stupa u interakciju s KV+ tvoreći veliki kompleks spojeva između kristal ljubičice i joda (kompleks spojeva CV-I) u unutarnjem i vanjskom sloju stanice. Ovaj kompleks spojeva zadržat će ljubičastu boju kristal ljubičice unutar stanice, na obojenim mjestima.
Jod je korozivna tvar. Izbjegavajte udisanje, gutanje ili kontakt s kožom
Korak 4. Dodajte izbjeljivač u boji, a zatim brzo isperite
Za ovaj važan korak obično se koristi mješavina acetona i etanola u omjeru 1: 1, koju je potrebno pažljivo rasporediti. Postavite tobogan pod određenim kutom, a zatim dodajte izbjeljivač u boji sve dok se u vodi koja se koristi za ispiranje više ne vidi ljubičasta. To obično traje manje od 10 sekundi, pa čak i manje vremena ako izbjeljivač sadrži visoku koncentraciju acetona. Odmah zaustavite ovaj korak jer će u protivnom boja također ispirati kristalno ljubičastu boju iz gram-pozitivnih i negativnih stanica, a postupak bojenja mora se ponoviti. Višak izbjeljivača u boji odmah isperite prethodnom tehnikom.
- Kao zamjena se može koristiti čisti aceton (95%+). Što više acetona koristite, izbjeljivač će brže djelovati pa morate obratiti više pažnje na vrijeme.
- Ako imate problema s praćenjem vremena za ovaj korak, dodajte izbjeljivač boja kap po kap.
Korak 5. Posipajte kontra-boju po razmazu, a zatim isperite
Kontra mrlja, obično safranin ili fuksin, koristi se za povećanje kontrasta između gram-negativnih i gram-pozitivnih bakterija, bojenjem obezbojenih (obezbojenih) bakterija, tj. Gram-negativnih bakterija, ružičastih ili crvenih. Ostavite najmanje 45 sekundi, zatim isperite.
Fuchsin će intenzivno bojati mnoge gram-negativne bakterije, poput Haemophilus spp i Legionella spp. Ova metoda je dobra za početnike
Korak 6. Osušite stakalce
Možete ih osušiti na otvorenom da se osuše ili ih osušiti pomoću bibuloznog papira koji se prodaje u tu svrhu. Proces bojenja po Gramu je dovršen.
Metoda 3 od 3: Provjera rezultata bojanja
Korak 1. Pripremite svjetlosni mikroskop
Stavite dijapozitiv pod mikroskop. Bakterije se uvelike razlikuju po veličini, pa će ukupno potrebno povećanje varirati od 400x do 1000x. Za oštriju sliku preporučuje se objektiv s uranjajućim uljem. Ispustite ulje za potapanje na stakalce, izbjegavajući pomicanje tijekom kapanja kako biste spriječili stvaranje mjehurića. Pomaknite ručicu leće mikroskopa tako da leća sjedne na mjesto i dodirne ulje.
Uranjanje u ulje može se koristiti samo na posebno dizajniranim lećama, a ne na "suhim" lećama
Korak 2. Pokušajte identificirati gram -pozitivne i gram -negativne bakterije
Pregledajte dijapozitiv pod svjetlosnim mikroskopom. Gram-pozitivne bakterije imaju ljubičastu boju jer je kristalna ljubičica zarobljena unutar debele stanične stjenke. Gram-negativne bakterije bit će ružičaste ili crvene boje, jer se kristalno ljubičasta ispire kroz tanke stanične stijenke, gdje ružičasta protuboja ulazi.
- Ako je uzorak predebeo, rezultat može biti lažno pozitivan. Obojite novi uzorak ako pokazuje sve gram -pozitivne bakterije, kako biste bili sigurni da je rezultat točan.
- Ako koristite previše izbjeljivača u boji, rezultat može biti lažno negativan. Obojite novi uzorak ako pokazuje sve gram -negativne bakterije, kako biste bili sigurni da je rezultat točan.
Korak 3. Usporedite rezultate koje vidite s referentnom slikom
Ako ne znate kako bakterije izgledaju, proučite zbirku referentnih slika, obično razvrstanih prema obliku i mrlji po Gramu. Također možete pregledati internetske baze podataka na [Nacionalna baza podataka o patogenima mikroorganizama, Bakterije u fotografijama i na mnogim drugim web stranicama. Kako bi se olakšala identifikacija, dolje su navedeni primjeri bakterija koje se često susreću ili su važne za dijagnozu, klasificirane prema njihovom statusu i obliku Grama.
Korak 4. Identificirajte gram-pozitivne bakterije na temelju njihovog oblika
Bakterije se dalje klasificiraju prema svom obliku pod mikroskopom, najčešće kao koke (sferne) ili šipke (cilindrične). Evo nekoliko primjera gram-pozitivnih bakterija (ljubičaste boje) prema njihovom obliku:
- Gram pozitivni koki obično stafilokoki (što znači skupni koki) ili streptokoki (što znači lančani koki).
- 'Gram pozitivne šipke kao što su Bacillus, Clostridium, Corynebacterium i Listeria. Bakterija štapića Actinomyces spp. obično imaju grane ili niti.
Korak 5. Identificirajte gram negativne bakterije
Gram-negativne bakterije (ružičaste boje) često se klasificiraju u tri skupine. Koki su okruglastog oblika, štapići su dugi i tanki, dok su kokoidni štapići između.
- Gram negativni koki Najčešći je Neisseria spp.
- Gram-negativne šipke npr. E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Serratia, Proteus, Salmonella, Shigella, Pseudomonas i mnogi drugi. Vibrio cholerae može se promatrati kao pravilna ili savijena stabljika.
- Gram-negativne bakterije "kokoidne" (ili "kokobacile") štapića npr. Bordetella, Brucella, Haemophilus i Pasteurella
Korak 6. Pažljivo provjerite jesu li rezultati pomiješani
Neke je bakterije teško precizno obojiti zbog krtosti ili voštane prirode njihovih staničnih stijenki. Ove bakterije mogu pokazati mješavinu ljubičaste ili ružičaste boje u istoj stanici ili između različitih stanica u istom razmazu. Bakterijski uzorci stariji od 24 sata mogu pokazati ovaj problem, ali postoje i neke vrste bakterija koje je teško obojati u bilo kojoj dobi uzorkovanja. Ove bakterije zahtijevaju specijalizirane testove za identifikaciju, kao što su bojanje otporno na kiseline, promatranje u bakterijskoj kulturi, TSI medij kulture ili genetsko testiranje.
- Actinomyces, Arthobacter, Corynebacterium, Mycobacterium i Propionibacterium spp. sve su gram-pozitivne bakterije, ali često nisu jasno obojene.
- Male, vitke bakterije kao što su Treponema, Chlamydia i Rickettsia spp. teško mrlja po Gramovoj metodi.
Korak 7. Odložite sav preostali potrošni materijal i opremu
Ovaj postupak zbrinjavanja otpada razlikuje se među laboratorijima i ovisi o upotrijebljenim materijalima. Obično se tekućina u ladici za bojenje odlaže u boce označene kao opasan otpad. Namočite stakalca u 10% -tnu otopinu izbjeljivača, a zatim ih odložite u posudu za oštre predmete.
Savjeti
- Upamtite da će rezultati bojenja po Gramu biti dobri samo ako je uzorak dobar. Važno je obavijestiti pacijente kako bi mogli dati dobar uzorak (npr. Razlika između pljuvanja i dubokog kašlja za dobivanje uzorka sputuma).
- Kao izbjeljivač u boji, etanol reagira sporije od acetona.
- Pridržavajte se standardnih laboratorijskih propisa kako biste osigurali sigurnost.
- Za vježbanje upotrijebite bris obraza, jer sadrži i gram-pozitivne i gram-negativne bakterije. Ako vidite samo jednu vrstu bakterija, možda koristite premalo ili previše izbjeljivača.
- Za pričvršćivanje kliznika možete koristiti drvene kopče.
Upozorenje
- Aceton i etanol su zapaljive tvari. Aceton će ukloniti ulje s vaših ruku, što će vašoj koži olakšati upijanje drugih kemikalija. Nosite rukavice i pažljivo ih koristite.
- Ne dopustite da se razmaz osuši prije nego što isperete Gramovu mrlju ili mrlju.
Što trebaš
- Uzorak mreže
- Stakleni tobogan
- Pipeta
- Mali izvor vatre, ili grijač s klizanjem, ili metanol
- Voda
- Kristalna ljubičica
- Jod
- Izbjeljivač u boji, poput alkohola ili acetona
- Safranin
