Spektrofotometrija je eksperimentalna tehnika koja se koristi za mjerenje koncentracije otopljene tvari u određenoj otopini izračunavanjem količine svjetlosti koju ta tvar apsorbira. Ova je tehnika vrlo korisna jer će određeni spojevi također apsorbirati različite valne duljine svjetlosti različitog intenziteta. Analizom svjetlosti koja prolazi kroz otopinu možete identificirati spojeve otopljene u otopini i njihove koncentracije. Alat za analizu otopina s ovom tehnikom u laboratoriju je spektrofotometar.
Korak
1. dio od 3: Priprema uzorka
Korak 1. Uključite spektrofotometar
Većinu spektrofotometara potrebno je zagrijati prije nego što mogu dati točna mjerenja. Dakle, pokrenite stroj i ostavite ga da odstoji najmanje 15 minuta prije mjerenja uzorka.
Iskoristite ovo vrijeme za pripremu uzorka
Korak 2. Očistite kivetu ili epruvetu
U školskim laboratorijima mogu biti dostupne epruvete za jednokratnu upotrebu koje se ne moraju prethodno očistiti. Međutim, ako koristite običnu kivetu ili epruvetu, prije upotrebe pažljivo očistite uređaj. Isperite sve kivete deioniziranom vodom.
- Budite oprezni pri korištenju kiveta jer su prilično skupe.
- Dok koristite kivetu, ne dodirujte stranu gdje prolazi svjetlo (obično čista strana posude).
Korak 3. Ulijte dovoljno uzorka u kivetu
Najveći volumen dijela kivete je 1 ml, dok je najveći volumen epruvete 5 ml. Vaša mjerenja trebaju biti točna sve dok svjetlost spektrofotometra još uvijek može prolaziti kroz uzorak, a ne kroz prazan dio spremnika.
Ako koristite pipetu za umetanje uzoraka, upotrijebite novi vrh za svaki uzorak. Na taj se način može izbjeći unakrsna kontaminacija
Korak 4. Pripremite kontrolnu otopinu
Ove otopine poznate i kao slijepe ili slijepe otopine sadrže samo otapalo u otopini koja se analizira. Na primjer, ako imate uzorak soli otopljen u vodi, slijepa otopina koja vam je potrebna je voda. Ako je voda koju koristite crvena, trebali biste upotrijebiti i crvenu otopinu. Upotrijebite sličnu posudu za držanje slijepe otopine u istom volumenu kao i uzorak.
Korak 5. Obrišite vanjsku stranu kivete
Prije umetanja kivete u spektrofotometar morate osigurati da je čista kako biste izbjegli smetnje u mjerenjima zbog čestica prašine ili nečistoća. Krpom koja ne ostavlja dlačice uklonite sve kapljice vode ili prašinu koja se slijepila s vanjske strane kivete.
2. dio od 3: Eksperimentiranje
Korak 1. Odredite i podesite valnu duljinu svjetlosti za analizu uzorka
Za povećanje učinkovitosti mjerenja upotrijebite jednu valnu duljinu svjetlosti (jednobojni snop). Odaberite boju svjetlosti koju može apsorbirati kemijski sadržaj za koji se smatra da je otopljen u ispitivanom uzorku. Podesite valnu duljinu prema specifikacijama spektrofotometra koji koristite.
- U školskim laboratorijima te će valne duljine obično biti navedene u eksperimentalnim uputama.
- Budući da će uzorak reflektirati svu vidljivu svjetlost, valna duljina boje eksperimentalne svjetlosti obično se uvijek razlikuje od boje uzorka.
- Objekt izgleda određene boje jer odražava određenu valnu duljinu i upija sve ostale boje. Trava izgleda zeleno jer klorofil u njoj reflektira zelenu boju i upija druge boje.
Korak 2. Kalibrirajte spektrofotometar sa slijepom otopinom
Praznu otopinu stavite u držač kivete i zatvorite spektrofotometar. Na ekranu analognog spektrofotometra nalazi se igla koja će se pomicati na temelju intenziteta detekcije svjetlosti. Nakon umetanja slijepe otopine, igla bi se trebala pomaknuti udesno. Zapišite ovu vrijednost u slučaju da vam kasnije zatreba. Ostavite slijepu otopinu da ostane u spektrofotometru, a zatim pomaknite iglu na nulu pomoću gumba za podešavanje.
- Digitalni spektrofotometri također se mogu kalibrirati na isti način. Međutim, ovaj je alat opremljen digitalnim zaslonom. Očitavanje slijepe otopine postavite na 0 pomoću upravljačkog gumba.
- Čak i ako se slijepa otopina ukloni iz spektrofotometra, kalibracija će i dalje biti važeća. Dakle, kad izmjerite cijeli uzorak, apsorbancija slijepog uzorka će se automatski smanjiti.
Korak 3. Uklonite slijepu probu i testirajte rezultate kalibracije spektrofotometra
Čak i nakon što se slijepa otopina ukloni iz spektrofotometra, igla ili broj na ekranu i dalje bi trebali biti 0. Vratite praznu otopinu natrag u spektrofotometar i pazite da se očitanje ne promijeni. Ako je spektrofotometar pravilno kalibriran pomoću slijepe otopine, rezultat na ekranu bi i dalje trebao biti 0.
- Ako igla ili broj na zaslonu ne očitavaju 0, ponovite korake kalibracije s praznom otopinom.
- Ako problem potraje, potražite pomoć ili neka netko provjeri spektrofotometar.
Korak 4. Izmjerite apsorbanciju uzorka
Uklonite slijepu otopinu i umetnite uzorak u spektrofotometar. Pričekajte oko 10 sekundi da se kazaljke stabilizuju ili se brojke na digitalnom zaslonu prestanu mijenjati. Zabilježite postotak propusnosti i/ili apsorbancije uzorka.
- Što se više svjetlosti prođe, manje se svjetlosti apsorbira. Obično morate zabilježiti vrijednost apsorbancije uzorka koja se općenito izražava kao decimalni broj, na primjer 0,43.
- Ponovite mjerenje svakog uzorka najmanje tri puta, a zatim izračunajte prosjek. Na taj će način rezultati koje dobijete biti točniji.
Korak 5. Ponovite eksperiment s različitim valnim duljinama svjetlosti
Vaš uzorak može sadržavati nekoliko spojeva koji imaju različitu apsorpciju ovisno o valnoj duljini svjetlosti. Kako biste smanjili nesigurnost, ponovite mjerenje uzorka u intervalima od 25 nm valne duljine u cijelom svjetlosnom spektru. Na taj način možete otkriti druge otopljene kemikalije u uzorku.
Dio 3 od 3: Analiza podataka o apsorpciji
Korak 1. Izračunajte propusnost i apsorbanciju uzorka
Propusnost je koliko svjetlosti može proći kroz uzorak i doći do spektrofotometra. U međuvremenu, apsorpcija je količina svjetlosti koju apsorbira jedna od otopljenih kemikalija u uzorku. Postoji mnogo modernih spektrofotometara koji daju izlaz u obliku propusnosti i apsorbancije. Međutim, ako dobijete vrijednost intenziteta svjetlosti, također možete sami izračunati ove dvije vrijednosti.
- Propusnost (T) može se odrediti dijeljenjem intenziteta svjetlosti koja prolazi kroz otopinu uzorka s količinom svjetlosti koja prolazi kroz slijepu otopinu. Ta se vrijednost obično izražava kao decimalni broj ili postotak. T = I/I0, gdje je I intenzitet uzorka i I0 je intenzitet slijepe probe.
- Apsorbancija (A) izražena je kao negativna baza 10 propusnost logaritma (eksponent): A = -log10T. Dakle, ako je T = 0, 1, A = 1 (0, 1 je 10 na stupanj -1). To znači da 10% svjetlosti prođe, dok se 90% apsorbira. U međuvremenu, ako je T = 0,01, A = 2 (0,01 je 10 na stupanj -2). To znači da je propušteno svjetlo 0,1%.
Korak 2. Ucrtajte vrijednost apsorbancije u odnosu na valnu duljinu
Izrazite vrijednost apsorbancije kao os y, a valnu duljinu kao os x. Od točaka svih rezultata apsorbancije na svakoj valnoj duljini dobit ćete spektar apsorbancije uzorka i identificirati sadržaj spoja i njegov omjer u uzorku.
Spektri apsorbancije obično imaju vrhove na određenim valnim duljinama. Ove vršne valne duljine omogućuju vam identifikaciju specifičnih spojeva
Korak 3. Usporedite svoj spektar apsorbancije s grafikonom poznatog spoja
Svaki spoj ima jedinstveni spektar apsorbancije i uvijek ima istu vršnu valnu duljinu pri svakom mjerenju. Uspoređujući grafikon koji dobijete s grafikonom određenog poznatog spoja, možete identificirati sadržaj otopljene tvari u otopini uzorka.
